M88体育-明升M88体育讯（通讯员 万梓豪）近日，我校资源与环境学院环境与生物分析课题组在聚合物仿生亲和配体理性设计及定向化学进化研究领域取得新进展，相关成果以“A Peptide Epitope−Synthetic Hydrogel Polymer Conjugate That Mimics Insecticidal Protein Receptors. Application in Environmental and Biological Analysis”为题在Chemical Engineering Journal上在线发表。该论文报道了一种基于理性设计和定向化学进化策略筛选的多肽表位-人工合成水凝胶共聚物偶联物，该偶联物对多种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白（Bt Cry 蛋白）变体具有广谱亲和力，可以实现转基因和非转基因作物的准确、快速鉴别。
转Bt基因作物对农业害虫防治以及世界粮食供应具有深远影响，随着CRISPR技术的出现，这些影响可能进一步加剧。尽管转基因作物被认为是有益和有利的，但为了确保遵守监管机构的法规并对杂交育种进行跟踪，监测转基因作物已成为政府监管的一个重要组成部分。利用酶联免疫分析法（ELISA）检测Bt Cry蛋白是目前转基因作物监测的一个重要手段。由于生物抗体的高度特异性，一种商用ELISA试剂盒通常只能检测出一种Bt Cry蛋白变体。目前，已有多种Bt Cry蛋白变体通过基因工程手段成功修饰到重要的商业作物中，鉴别一种作物是否含有转基因成分往往需要选择多种ELISA试剂盒对其逐一进行检测才能最终得到确定，大大增加了监管的难度和监测的成本。因此，开发一种对不同Bt Cry蛋白变体具有高亲和力、高特异性的广谱型非生物亲和配体对转基因作物监测具有重要意义。
多肽表位-水凝胶共聚物合成示意图
研究人员通过晶体结构及分子识别机制分析，发现位于烟草天蛾类钙黏蛋白Bt-R1重复单元CR7上的一段受体表位NITIHITDTNNK是识别Bt Cry蛋白变体的共同独特型。该多肽序列与许多重要的BtCry蛋白家族类钙粘蛋白受体表位具有高度相似性，因此可以用于Bt Cry蛋白变体的广谱识别。虽然选择的昆虫受体多肽表位可以实现Bt Cry蛋白变体的生物识别，但多肽本身由于缺乏必要的物理、机械和化学特性，很难直接用于Bt Cry蛋白变体的提取、分离、富集和ELISA分析，而将多肽表位偶联到合成的水凝胶共聚物中可以使多肽具有良好的鲁棒性、粘附性、可加工性和多价展示性。
鉴于此，研究以多肽表位NITIHITDTNNK为主要功能单体，丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺或甲基丙烯酸甲酯为共同单体，合成出一个小而聚焦的多肽表位-水凝胶共聚物文库，对文库进行筛选得到对多种Bt Cry家族蛋白变体，包括Bt Cry1Ab，Bt Cry1Ac，Bt Cry1C，Bt Cry1F和Cry2A，具有广谱识别能力，吸附容量高、吸附速度快，且具有pH敏感的吸附-解吸特性的多肽表位-水凝胶共聚物，将其作为选择性吸附剂用于水和土壤中Bt Cry蛋白的萃取、分离和富集。同时，以生物素标记的多肽表位-水凝胶共聚物为识别元件（非生物抗体）建立Bt Cry蛋白变体的ELISA分析方法，并用于转基因和非转基因棉花和大米的鉴别。与传统ELISA方法相比，该方法具广谱识别能力，只需要采用一个自制的ELISA试剂盒即可将不同Bt Cry蛋白基因修饰的转基因棉花鉴别出来，方法的线性范围宽、准确度高。但该方法在鉴别转基因大米时由于受背景干扰的影响可能造成假阳性结果，如何消除背景干扰问题是研究后期需要进一步解决的问题。
a）不同单体组成及配比的多肽表位-水凝胶共聚物对BtCry1Ac蛋白亲和能力的筛选
b) 筛选的多肽表位-水凝胶共聚物P4对BtCry家族蛋白以及常规蛋白的选择性比较
多肽表位-水凝胶共聚物在BtCry蛋白样品预处理以及ELISA分析中的应用
前期工作中，研究人员通过分析BtCry1Ab/Ac蛋白与烟草天蛾类钙粘蛋白受体Bt-R1复合物的晶体结构、结合表位以及热点区域，设计和筛选出两种对BtCry1Ab/Ac蛋白具有选择性识别能力的聚合物仿生亲和配体，分别为以丙烯酸以及苯丙氨酸为单体合成的水凝胶聚合物纳米颗粒，研究成果在Journal of American Chemical Society和ACS Applied Materials & Interfaces上发表。该研究在此基础上，将多肽功能单体引入水凝胶共聚物中，使得到的非生物亲和配体对BtCry 族蛋白变体具有更高的吸附容量，更强的亲和力，更快的吸附动力学，以及广谱的分子识别能力。
我校资源与环境学院博士研究生万梓豪为该论文的第一作者，资源与环境学院刘名茗教授和美国加州大学欧文分校Kenneth J. Shea教授为该论文的共同通讯作者。我校作物遗传改良国家重点实验室、国家植物基因研究中心林拥军教授，资源与环境学院谭文峰教授和陈秀华副教授对该研究工作给予了大力支持。该研究工作得到国家自然科学基金、中央高校基本科研业务费专项资金、教育部新世纪优秀人才支持计划、湖北省自然科学基金、国家转基因育种重点专项以及美国国家科学基金的资助。
审核人：刘名茗
【英文摘要】
Monitoring transgenic crops (GMOs) is essential to track cross-breeding and ensure regulatory compliance but multiple protein variants now engineered into important crops challenges conventional antibody detection. Analysis of Bacillus thuringiensis (Bt) Cry protein − insect receptor complexes identified a peptide epitope, NITIHITDTNNK, with high sequence similarity to cadherin-like receptors across a family of Bt Cry proteins for broad-spectrum recognition. The peptide lacks the necessary physical, mechanical and chemical properties for practical applications. Conjugation of the peptide to a synthetic polymer creates a hybrid material that imparts robustness, adhesion, processability and polyvalence to the epitope. An epitope − hydrogel polymer conjugate library is created and screened for Bt Cry protein binding. A candidate with high adsorption capacity (∼995 mg g−1), fast adsorption kinetics (within 2 min), broad-spectrum specificity, and pH-responsive catch-and-release is identified as a selective sequestrant for extraction and isolation of Bt Cry variants from water and soil samples. An enrichment factor of 9.0 ∼ 12.5 and a linear range of 0.09 ∼ 0.45 µg g−1 was obtained for soil samples. The biotinylated epitope − polymer conjugate, a recognition element entirely different from an antibody, is integrated into an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for identification of cotton and rice crops transgenic with a variety of Bt Cry variants. The established ELISA assay exhibits wide linear range (0 ∼ 50 ng mL−1) and high accuracy (95.4 ∼ 108 %) for GMO cotton leaves. However, to distinguish GMO rice from non-GMO ones, background interference still needs to be overcome. We are now working for a more effective diagnostic for GMO rice.
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